本試劑盒用于體外檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人血管內皮細胞生長因子 （VEGF）的含量。 實驗原理： 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人血管內皮細胞生長因子 （VEGF）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。 用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺 和樣品中的人血管內皮細胞生長因子（VEGF）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）， 計算樣品濃度。 樣本處理及要求： 1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上 清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。 2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分 鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。 3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測 量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織 樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑） 加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍 融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。 4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或 -80℃保存，但應避免反復凍融。 注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。 需要而未提供的試劑和器材： 1. 酶標儀（450nm） 2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒溫箱 4. 蒸餾水或去離子水2021 版 本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫(yī)學診斷 3 試劑盒組成： 名稱 96 孔配置 48 孔配置 備注 微孔酶標板 12 孔×8 條 12 孔×4 條 無 標準品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 無 樣本稀釋液 6mL 3mL 無 檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無 20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進行稀釋 底物 A 6mL 3mL 無 底物 B 6mL 3mL 無 終止液 6mL 3mL 無 封板膜 2 張 2 張 無 說明書 1 份 1 份 無 自封袋 1 個 1 個 無 備注： 1. 標準品濃度依次為：2000、1000、500、250、125、62.5 pg/ml 2. 經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中 直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本 進行適當稀釋后再進行實驗。 注意事項： 1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃。 使用后立即冷藏保存試劑。 2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干 燥掉。 3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。 4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。 5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。 6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。 7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。 8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應 試劑的生物活性。 9. 不能使用過期產品。 10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。 試劑準備：2021 版 本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫(yī)學診斷 4 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。 操作步驟： 1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。 2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL； 3. 樣本孔中加入待測樣本 50μL；空白孔不加。 4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體 100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。 5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置 1min，甩去洗滌液，吸水 紙上拍干，如此重復洗板 5 次（也可用洗板機洗板）。 6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。 7. 每孔加入終止液 50μL，15min 內，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。 實驗結果： 以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標 準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。 （此圖僅供參考） 試劑盒性能： 1. 檢測范圍：62.5 pg/ml – 2000 pg/ml。 2. 靈敏度：檢測濃度小于 10 pg/ml。 3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。 4. 重復性：板內變異系數小于 10% ，板間變異系數小于 15% 。